肝臟作為藥物暴露的主要器官，在藥物的代謝和毒性過程中起著至關重要的作用。原代肝細胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結合酶【如細胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶，為滑面內質網中的還原酶】，也包括胞質酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認為是構建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。因此，本文概述了基于原代肝細胞的二維（2D）和三維（3D）培養模型及其在藥物研發中的運用。

一、原代肝細胞分離

大多采用兩步膠原酶灌注法。較小動物可通過門靜脈或下腔靜脈進行肝臟灌注。較大動物通過肝葉或肝節段灌注。成功分離肝細胞的幾個關鍵因素：第一，無細胞毒性的膠原酶。第二，恰當的消化時機。消化不足和消化過度都會損害肝細胞的產量和活力。第三，良好的肝臟狀況。肝細胞對缺血性損傷非常敏感。用于制備肝細胞的肝臟應迅速冷卻，以降低代謝速率防止代謝性缺氧和隨后的缺血。分離的原代肝細胞用于藥物研究的標準：1、實驗開始時活率> 80%，在整個實驗過程中活率下降< 20%；2、對2-3種已知上市藥物的代謝進行檢測，與文獻值相當；3、誘導實驗中典型誘導劑如利福平應使特定酶(CYP3A4)活性增加至少3倍；4、代謝和轉運體研究中，凍存肝細胞胞接種4-6 h后貼壁率>70%。

二、原代肝細胞2D培養

懸浮肝細胞（Suspension Hepatocytes）模型

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擁有完整的藥物代謝酶和輔助因子，可用于不同代謝清除途徑的研究。然而，懸浮肝細胞(Suspension Hepatocytes)的活率和藥物代謝酶活性隨著體外孵育時間增加會逐漸降低，限制其孵育時間最長為4小時，一般用于估計中、高清除速率藥物的清除。當清除速率小于20%時，不能準確確定清除值。傳統的懸浮肝細胞體外代謝研究模型不足以使慢代謝化合物產生足夠被檢測到的代謝反應，所以在預測慢代謝化合物的清除率及其代謝產物方面存在局限性。可采用懸浮肝細胞接力方法（圖1），孵育時間可延長至20小時甚至更長。

應用：小分子藥的酶活性和代謝穩定性研究。

圖1. 懸浮肝細胞接力法轉移流程DRUG METAB DISPOS, 2012,40(9):1860–1865

貼壁肝細胞（Plateable Hepatocytes）模型

原代肝細胞2D培養于膠原蛋白包被的培養物表面。肝細胞呈現上皮形態，細胞核突出，常呈雙核狀。單一肝細胞貼壁培養的缺陷：1、細胞極性和功能發生改變；2、缺乏正常功能所需的其它相關細胞類型(即非實質細胞)；3、無法提供足夠的營養和旁分泌因子以支持肝細胞執行功能(如膽汁酸和血清蛋白的生物合成)。

應用：

★評價藥物-藥物相互作用:包括酶誘導、酶抑制和轉運體研究。首先，當藥物作為誘導劑時，可導致藥物代謝酶和轉運體表達增加。強效誘導劑可同時上調多個基因，如苯-巴比-妥誘導CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9、UGT以及MRP2等多種轉運蛋白。其次，不同種屬肝細胞對誘導劑反應存在差異。如利福平對人和兔肝細胞是一種有效的誘導劑，但對大鼠肝細胞無誘導作用。最后，貼壁肝細胞（Plateable Hepatocytes）亞理想的鋪板密度可能導致P450的基礎表達降低，并人為增加誘導反應，如圖3所示，貼壁肝細胞在較小鋪板密度時CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的基礎活性都較低，卻有更強的誘導反應。因此需要健康、合適鋪板密度的肝細胞來獲得生理學相關的數據。

圖2.凍存人肝細胞鋪板密度與酶誘導的關系Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7:188-198

★肝毒性評估：光鏡下觀察細胞形態、液泡和脂滴的聚集以及細胞的附著/脫落等形態學變化。檢測肝細胞壞死（谷草轉氨酶、乳酸脫氫酶和谷丙轉氨酶) 和凋亡（DNA斷裂）。對于細胞因子介導的細胞毒性，由于受鄰近的非實質細胞如Kupffer、星狀和竇狀內皮細胞釋放的物質調控，單一貼壁培養的肝細胞不能預測毒性反應。

★ "接力法"用于慢代謝化合物清除率及其代謝產物研究: 貼壁肝細胞藥物代謝酶活性在貼壁培養24 h 后開始降低。可將貼壁肝細胞用含待測化合物的無血清培養基孵育24小時后，收集培養基混合后置于新貼壁培養的肝細胞（圖3）。

圖3. 貼壁肝細胞接力法轉移流程Drug Metabolism Letters, 2016,10: 3-15

★評估靶向肝細胞的小核酸藥的細胞攝取、內吞、內體逃逸以及對靶基因的沉默效果。

三明治培養模型

在體外通過在兩層膠原或Matrigel內培養肝細胞可以重構體內結構，稱為三明治培養。肝細胞培養在兩層凝膠-膠原之間(夾心結構)，可改善肝細胞的形態和活力，并在培養中維持較長時間的功能。此外，三明治式培養的肝細胞可重新恢復極性，允許基底外側和小管轉運體

的適當定位以及功能性膽管網絡的形成（圖4）。

圖4.人肝細胞三明治模型中轉運蛋白的極化表達Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188-198

應用：

★估計化合物的膽道排泄。

★評估內源性和外源性化合物和代謝物的肝膽分布。

★估計代謝和轉運體介導的清除，構建基于生理學的藥代動力學模型。

★研究肝細胞毒性，提供臨床藥物性肝損傷的機制。數據整合到系統藥理學模型中預測人類潛在的藥物性肝損傷。

三、原代肝細胞3D培養

球狀體（Spheroid）模型

通過超低粘附培養、懸滴培養、磁化細胞培養等技術（圖5），原代肝細胞可不依賴外部基質，聚集形成直徑高達150-175µm的球狀團聚體。球狀體培養的一個優點是，每個球體只需要1330-2000個細胞，與其它3D培養技術相比顯著減少。最近的一項研究表明原代肝細胞球狀體培養可持續5周，CYP酶活性在第8天到第35天之間幾乎沒有變化。一項蛋白質組分析表明，與三明治培養相比，球形培養中負責藥物吸收、分布、代謝和排泄的酶能更好地保存14天。然而，肝臟比細胞團復雜得多。肝細胞的基底外側與血液接觸，在頂端側膽汁流出，這是復雜的肝小葉結構的主要特征，目前還不能在球狀體模型中復制。

應用：

★慢代謝化合物清除率及其代謝產物研究。

★肝細胞毒性研究。

★評估靶向肝細胞的小核酸藥的細胞攝取、內吞、內體逃逸以及對靶基因的沉默效果。

圖5.球狀體培養方法

肝類器官（Liver Organoids）模型

對類器官定義的共識是:來源于干細胞、祖細胞或分化細胞的3D結構，能夠在體外再現原生組織的某些功能和結構，可有效地再現體內微環境和細胞與細胞之間的相互作用。肝類器官已被確定為人類肝臟生物學研究的最-先進模型。

構建肝類器官的細胞來源：

多能干細胞(PSCs)：胚胎干細胞(ESCs)和誘導多功能干細胞(iPSCs)具有高多能性、可塑性和無限增殖能力，在特定信號轉導因子的作用下分化為具有活性和功能的肝細胞樣細胞。然而，PSCs誘導的肝類器官可能發生表觀遺傳和遺傳畸變，在擴增過程中表現出染色體非整倍體改變。

應用：

★構建遺傳性肝病模型

★構建感染性肝病模型

★藥物細胞毒性

★移植和肝臟疾病研究。

肝組織來源細胞：包括膽管細胞和肝細胞。成熟肝細胞在特定環境中仍具有干細胞潛能和增殖能力。與PSCs誘導的類器官相比，原代組織來源的類器官更成熟，基因組更穩定，在長期體外培養過程中保持了表型和遺傳穩定性。然而，與胎兒人肝細胞或成年小鼠原代肝細胞相比，成熟人肝細胞類器官的長期增殖能力有限。到目前為止，成人肝細胞類器官的培養仍然具有挑戰性。

培養方法（圖6）：肝組織消化成單細胞，將Matrigel/細胞混合物接種在24孔板中，以形成圓頂狀結構。細胞培養箱(37℃)中孵育15分鐘。凝固后加入特定培養基。大約14天后傳代。7-10天后，用分化培養基替換原來的培養基。

應用：

★肝毒性模型

★體外代謝紊亂研究。

★非酒精性脂肪肝疾病

★良性和惡性肝病的藥物開發

圖6. 組織源性肝類器官的培養和傳代過程Cell & Bioscience (2023) 13:197

球狀體培養與類器官培養比較

四、原代肝細胞共培養模型

2D原代肝細胞共培養模型

將兩種或兩種以上不同類型的細胞混合在2D培養環境中培養。其關鍵特征在于不同細胞之間的直接相互作用，細胞和細胞外基質的相互作用，或者通過細胞因子、化學通訊間接傳遞信號。原代肝細胞功能（如白蛋白產生和藥物代謝能力）可以維持長達3周。

★原代肝細胞與成纖維細胞共培養：用于慢代謝化合物清除率及其代謝產物研究。

★原代肝細胞與非實質肝細胞（星狀細胞，肝竇內皮細胞）共培養：用于藥物性肝損傷的研究，有助于研究細胞因子、趨化因子和生長因子在藥物暴露后調節肝臟適應性反應中的作用。

★原代肝細胞與T細胞共培養：檢測肝藥物代謝特異性T細胞反應。

★IPHASE也開發了不同種屬的原代肝細胞共培養系統HepatoMaxTM（圖7），通過原代肝細胞與基質細胞共培養，可以實現人原代肝細胞在3周內保持良好的藥物代謝酶活性，適用于慢代謝化合物清除率及其代謝產物研究。

圖7. IPHASE人原代肝細胞共培養系統

3D原代肝細胞共培養模型

直接3D共培養：將兩種或多種不同類型的肝細胞（原代肝細胞、肝竇內皮細胞、肝星狀細胞、枯否氏細胞）混合成自組裝球體，或在膠原蛋白、纖維蛋白、海藻酸鹽和水凝膠等構建的3D環境中共同培養。直接3D共培養可以使不同肝細胞緊密接觸，通過細胞間直接黏附、可溶性細胞因子旁分泌、細胞外基質黏附等機制實現肝細胞間的信號通信。

應用：

★構建肝纖維化模型

★構建藥物性肝損傷模型

★評估藥物相互作用、藥物代謝和酶誘導。

間接三維共培養：采用物理分離系統（Transwell或各種材料）將兩種或兩種以上類型的細胞（如原代肝細胞與NIH/3T3細胞或肝竇內皮細胞）在3D環境中分層培養，物理分離系統兩側的細胞之間不允許直接接觸，它們之間的信號通過可溶性細胞因子進行溝通。

應用：研究非接觸式肝細胞在體通信。

綜上所述，IPHASE作為體外研究生物試引-領者，為助力藥物體外非臨床研究，從多種屬原代肝細胞的分離、培養，到相應輔助產品如不同應用場景下的配套培養基或不同需求下的多規格膠原包被板；從提供產品到提供原代肝細胞的分離、培養服務，IPHASE始終如一，致力于為客戶提供最-好的藥物體外非臨床研究“武-器"，是廣大客戶優選的合作伙伴！

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